"GM-CSF 전처치"로 혈관내피세포 재생 촉진
연구개요 및 목표
동맥경화에 의한 혈관의 협착을 치료함에 있어 풍선을 이용한 혈관확장술은 매우 유용한 방법으로 실제 임상에서 널리 이용되고 있다.
하지만 혈관 확장술 후 적게는 20%에서 많게는 50%에 이르는 재협착이라는 문제점이 있다.
이러한 방지를 위하여 실제 임상에서 사용되기 시작한 혈관내 방사선 요법은 매우 효과적인 치료법임이 널리 알려져 있다.
하지만 그 기전의 한계로 인하여, 효과 못지않게 부작용이 수반되어지고 있다. 방사선 치료는 재협착의 주요 기전으로 알려진 활발히 증식하는 혈관평활근세포의 증식을 효과적으로 억제하였으나 염증세포의 침윤을 방지하고 혈전형성을 억제하는 혈관내피세포 역시 손상을 받아 혈관의 장벽인 내피 재생이 지연됨에 따라 혈전 형성과 혈관 내 염증 반응이 유도되어 일정 시간이 지난 후에는 재협착이 다시 발생되는 문제점(delayed catch-up restenosis)이 보고되고 있다.
혈관내피세포의 재생은 전통적으로 손상받은 혈관 주위의 정상혈관에 존재하는 내피세포가 이동하고 증식하여 손상부분을 일정부분 재생시킬 것으로 생각되어 왔으나, 최근 연구 결과들은 인근에 존재하는 내피세포 뿐만 아니라, 골수에서 기원하는 줄기세포의 일종인 혈관내피 전구세포가 중요한 역할을 할 것임이 시사되어졌다.
특히 방사선 치료는 인근의 정상내피세포가 거의 소실되는 치료의 부작용적인 측면이 있어, 주위 세포가 이동하고 증식하기를 기대하기에 어려움이 있다. 이에 본 연구자들은 토끼 장골 동맥 혈관내 방사선 치료 모델을 이용하여 골수로부터 줄기세포를 동원하여 혈관내피를 적극적인 방법으로 재생하고자 하였다.
연구내용 및 성과
본 연구실에서 자체적으로 실험방법으로 확립한 토끼 장골동맥 혈관성형술 모델을 사용하여으며, 골수 줄기세포의 동원을 위하여, 이미 혈액질환 치료에 사용되는 줄기세포 동원 사이토카인의 일종인 GM-CSF를 피하 주입하였다.
단계 I : 혈관내 방사선 치료 후 이점과 부작용 분석 및 GM-CSF 전처치 후의 변화 분석
풍선손상만 가한 혈관에 비해, 방사선 치료를 추가한 경우에 있어 재협착이 유의하게 감소함을 그림 1에서 나타낸 바와 같이 조직소견에 관찰할 수 있었다.
그리고, GM-CSF 전처치를 시행한 후 방사선 치료를 추가하였을 때 다른 모든 군과 비교하여, 통계적으로 유의하게 재협착의 정도가 감소함을 관찰하였다.
이러한 차이점의 원인을 분석하고자, 혈관 염증에서 가장 중요한 역할을 하는 대식세포에 대한 면역조직화학염색을 그림 2에서와 같이 실시하였다.
방사선 치료를 시행한 혈관에는 대식세포의 cladvs에 의한 심한 염증이 관찰되었다. 하지만, GM-CSF 피하주하를 시행한 후 방사선 치료를 시행한 혈관에 있어서는 재협착의 유의한 감소 뿐만이 아니라, 혈관염증의 현저한 감소 또한 관찰할 수 있었다.
단계 II : GM-CSF 전처치로 인한 내피세포 재생양상의 분석
GM-CSF 전처치를 시행한 경우, 대조군에 비해 재협착의 감소 뿐만아니라, 혈관 염증 또한 헌저하게 감소하여 그 기전을 분석하고자 하였다. 혈관 염증을 방지하는 내피세포의 재생양상을 분석함으로써, GM-CSF 전처치가 혈관내피세포의 재생을 촉진함을 관찰할 수 있었다.
그림 3에서 관찰되는 바와 같이 방사선 치료군에서는 내피세포 재생이 매우 지연되는 반면 GM-CSF를 전처치한 후 방사선 치료를 시행한 경우에는 내피세포 재생이 현저하게 촉진됨을 관찰하였으며, 이는 통계적으로도 대단히 유의하였다.
이로써, 방사선 치료는 혈관 손상 후 재협착을 효과적으로 줄일 수 있었으나, 내피세포 재생의 지연에 따라 심각한 혈관 내 염증을 유발함을 알 수 있었으며, 이를 극복하기 위하여 시행한 GM-CSF의 전처치는 혈관 내피세포의 재생을 효과적으로 촉진하여, 재협착의 빈도 감소뿐만아니라, 혈관염증의 소실을 유도하였다.
단계 III : GM-CSF 전처치 후의 혈관내피전구세포의 동원 및 성장양상
GM-CSF의 전처치가 혈관내피재생을 촉진하는 기전을 분석하고자, 골수 유래 내피전구세포의 동원양상을 관찰하였다.
△혈관내피전구세포의 동원양상- 토끼의 말초혈액을 분리하여 골수 유래 내피전구세포을 분석한 결과 GM-CSF전처치군에서 유의하게 많은 혈관내피 전구세포가 말초혈액에서 관찰되는 것은 FACS 분석에서 관찰하였다.
이로써 GM-CSF의 전처치는 골수로부터 내피전구세포의 동원을 촉진함을 알 수 있었다.
△혈관내피전구세포의 성장 양상 비교- 말초혈액내로의 내피전구 세포의 동원양상 뿐만 아니라 성장양상의 비교를 위하여 내피전구세포 특이 배양양환경에서 4주간 배양한 결과 GM-CSF 전처치군에서 대조군에 비해 월등히 많은 내피전구세포가 배양됨을 관찰하였다.
형광현미경하에서 내피전구세포 특이적인 Dil-LDL uptake 와 BS-1 lectin binding 표지자를 이용하여 이중 염색을 시행하여, 배양되는 세포 중 내피전구 세포의 수만을 특이적으로 비교한 결과 GM-CSF 전처치는 대조군에 비해 통계적으로 매우 유의하게 내피전구세포의 성장을 촉진함을 관찰하였다.
단계 IV : 혈관내피전구 세포의 손상부위로의 회귀 양상
배양된 내피전구세포에 그림 붉은색 형광으로 표식을 한 후 다시 토끼에 주입한 결과, 손상을 받은 혈관부위 및 실험과정에서 유도된 목의 허혈부위로의 회귀가 관찰되었다.
하지만, 손상을 받지 않은 혈관으로는 회귀가 일어나지 않음을 관찰할 수 있었다. 이는 말초혈액으로 동원된 내피전구세포는 손상 특이적인 회귀양상이 있음을 나타낸다고 할 수 있다.
연구 결론
이상에서 시행한 4단계의 연구 성과를 요약하려 종합하면, 혈관내 방사선 치료는 풍선 시술 후 재협착의 빈도를 현저히 감소시키는 긍정적인 효과가 있는 반면, 내피세포의 재생지연에 따른 혈관 내 염증 반응이 유도되는 부정적인 측면이 관찰되었다.
이에 연구자들은 내피세포의 재생을 그 근본 해결책으로 생각하고, 골수로부터 내피전구세포를 GM-CSF라는 사이토카인을 이용하여 동원하는 방법으로 이와 같은 문제점을 해결하고자 하였다.
그 결과 내피재생이 유의하게 촉진되었으며, 이로 인하여 혈관의 염증반응도 차단할 수 있었다. 이에 더하여, 혈관내 방사선치료의 긍정적인 효과인 재협착 방지의 정도는 추가적으로 더욱 향상되는 고무적인 결과를 관찰하였다.
본 연구자들이 사용한 GM-CSF는 이미 암환자에게서 널리 사용되어지고 있는 약물로 그 안전성이 검증되어 있으며, 피하주입이라는 대단히 간편한 주입방법이 있어, 임상적인 적용에 있어 그 효용성이 지대하리라 생각된다.
