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신장이식의 바이오마커
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[0호] 승인 2014.05.15  16:04:57
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이식 장기에 대한 면역반응의 극복
사람마다 각기 다른 사람백혈구항원(human leukocyte antigen, HLA)이라는 다형 유전자(polymorphic gene)를 가지고 있으며, 이는 이식 과정에서 내가 아닌 타인을 인식하는 지문 같은 역할을 한다. 우리 몸의 면역체계는 외부로부터 들어온 바이러스, 박테리아와 같은 병원체가 자신의 것과 다르다고 인식하면 이를 공격하여 제거한다. 이식을 하는 경우 이러한 현상이 거부반응으로 나타나 문제가 된다.
따라서 이식을 할 때는 거부반응을 막기 위한 세 가지 전략이 필요하다. 첫 번째는 HLA가 모두 동일한 사람으로부터 이식을 받는 것인데, 이는 일란성 쌍둥이가 아닌 경우 거의 불가능하다. 두 번째는 거부반응을 예방하기 위해 면역억제제를 사용하는 방법이다. 이식을 받은 모든 사람은 평생 면역억제제를 복용해야 하는데, 면역을 너무 많이 억제하는 경우 감염, 암 등이 발생할 우려가 있어 적절한 조절이 필요하다. 면역억제제는 이식에 대한 면역만 억제하는 것이 아니라 다른 것들에 대해서도 비특이적으로(non-specific) 억제하기 때문이다. 또한 면역억제제는 그 자체로 독성이 있기 때문에 주의해야 한다. 세 번째는 모든 외부로부터 들어온 것들이 아닌 이식받은 장기만 내 것으로 인식하는 선택적 관용(selective tolerance)을 획득하는 것이다. 이를 위해 현재까지 가장 많이 연구된 방법은 면역세포를 생성하는 골수를 신장과 같이 이식하여 관용을 획득하는 것이다. 이식받은 골수가 기존의 몸을 공격하는 문제가 생길 수 있지만, 이는 다양한 방법으로 조절할 수 있다. 우리나라에서도 골수를 함께 이식해서 관용을 획득해 면역억제제를 중단한 증례가 크게 보도된 바 있다. 단점으로는 골수이식은 신장이식에 비해 비용도 높고, 합병증도 많다는 점이다.
 

이식 환자의 모니터링 필요성
면역억제제는 급성, 만성 거부반응을 예방할 수 있게 하지만 역설적으로 신장을 오래 사용하지 못하게 하는 원인으로도 작용한다. 장기간의 면역억제제 사용은 신장의 염증, 섬유화가 서서히 진행되어 결국 장기를 사용할 수 없게 한다. 또한 면역억제제 자체의 급성 신독성으로 인해서도 문제가 나타날 수 있다. 류마티스관절염에 효과가 있는 tacrolimus, cyclosporine 등의 면역억제제는 상당수 환자에서 신장이 나빠져 결국 투여를 중단할 정도로 신독성을 나타내므로 신장이식 환자가 평생 이러한 약제를 복용하는 것은 결국 신장이식 후 신독성 약제를 사용하는 것과 마찬가지로 볼 수 있다. 특히 문제가 되는 것은 환자들 개인마다 상태가 다르지만 면역억제제는 똑같이 복용하게 된다는 사실이다. 따라서 어떤 사람은 면역억제제 효과가 부족하게 나타날 수도 있고, 어떤 사람은 너무 과할 수도 있다. 오랜 치료 경험으로 조정할 수 있는 부분이 있지만 기본적으로 이식 후 상당 기간 동안에는 일률적으로 동일한 면역억제제를 투여한다. 따라서 각 개인에 따른 치료 전략 및 모니터링이 필요하며, 현재 이 부분에 대한 연구가 진행 중이다.
이식 후에는 면역, 신장기능 등 여러 가지를 모니터링해야 한다. 이식을 하는 순간 장기는 손상이 일어나기 시작하므로 이를 막기 위해 면역억제제를 투여한다. 임상적으로는 큰 변화를 보이지 않지만 실제로는 손상이 서서히 진행되고 있다. 이를테면 환자의 creatinine 수치에 변화가 없었고 단백뇨도 관찰되지 않다가 어느 순간 관찰되었다면, 이는 갑자기 생긴 것이 아니라 신장 안에서 이미 preclinical한 변화가 생겨왔음을 의미한다. 감염, 면역세포 소집, T세포의 조직 인식, 대식세포(macrophage)의 활동 등으로 조직이 많이 손상되어야 creatinine 수치가 상승한다. 그 전에는 어떠한 과정이 계속 진행되는데 이는 이식 직후부터 시작된다. 이런 preclinical 손상 과정은 분자생물학적인 변화를 동반하게 된다. 따라서 RNA, 단백질, 펩티드, 대사체(metabolite) 등의 변화가 실제 임상적으로 나타나기 전인 preclinical 손상 과정에서 미리 분석하여, 거부반응이 생기기 전에 치료를 시작하고 면역억제제의 독성도 미리 대비하는 것이 치료에 도움이 될 것이다. 생체 조직검사(biopsy)를 통해 이런 변화를 확인할 수 있지만, 신장의 경우 혈액이나 소변으로도 쉽게 진단할 수 있다면 불필요한 신장 조직검사를 피할 수 있다는 장점이 있다<그림1>.

   
 


 

이식 환자에서 모니터링의 내용
유전자가 처음부터 많이 안 맞는 것과 같은 기본적 위험요소(baseline risk)의 경우 이식 후 과정에 결정적인 영향을 주는 것은 아니므로 모니터링의 바이오마커(biomarker)로 적합하지는 않다. 바이오마커 연구가 활발히 진행되기 전에는 주로 두 가지를 모니터링했는데 첫 번째는 면역세포를 모니터링하는 것으로, 환자의 면역세포를 fluorescence activated cell sorting (FACS) 등을 이용하여 관찰하는 것이다. 또 하나는 creatinine 수치가 올라가기 전에 이식된 장기의 상태를 모니터링하는 것이다.
우리 몸의 면역세포는 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)가 주로 포함되는 선천성 면역(innate immunity), T세포, B세포가 주로 포함되는 후천성 면역(adaptive immunity)으로 분류된다. T, B세포는 subpopulation이 다양하게 있는데, 염증을 많이 일으키는 CD4+, CD8+, 효과 T세포(effector T cell), 기억 T세포(memory T cell)나, 항체를 많이 만드는 B세포 중 하나인 형질세포(plasma cell) 등이 있다. 염증을 막아주는 면역세포인 조절 T세포(regulatory T cell)도 있고, 아직 잘 밝혀지지 않았지만 B세포에서도 면역을 조절하는 B세포가 있다. 또한 기능 면에서 보면 T세포에서는 형질전환성장인자-베타(transforming growth factor-β,TGF-β), interleukin-17 (IL-17), B세포에서는 IL-10 같은 regulatory cytokine 등을 분비한다. 병리학적으로 T세포는interferon-γ (INF-γ), IL-17을, B세포에서는 항체 등을 FACS로 surface marker를 확인해서 측정할 수 있다. 하지만 이런 방법은 각종 감염 등의 변수에 의해 측정에 영향을 미칠 수 있어 거부반응을 명확하게 관찰하는 데는 한계가 있다. 따라서 생체 검사를 통한 침습적인 방법에 의해 병리학 및 조직학적으로 RNA, 펩티드 등을 분석하는 것이 정확하다. 하지만 생체 검사를 했더라도 실제로 정확히 분석하는데 한계가 있다. 그런 면에서 비침습적으로 소변이나 혈액에서 측정하는 것이 얼마나 어려운 일인지 짐작할 수 있다. 비침습적으로 확인하는 방법으로는 FACS를 통해 환자의 말초혈액 백혈구에서 RNA의변화, T세포 레퍼토리(repertoire)의 변화, 히스톤 아세틸화(histone acetylation)의 변화 등을 확인하는 것이 해당된다. 또한 실제 kit를 통해 비침습적인 방법으로 기능을 확인하는 검사에는 enzyme-linked immunospot (Elispot)이 있으며, 이는 기증자의 항원을 투입 시 IFN-γ를 형성하는 능력을 확인하는 것이다. 이 외에도 cytokine이 면역세포에서 분비되는 것을 보는 검사 등 여러 가지가 있다. 하지만 어떠한 방법도 실제로 임상에 적용하기는 쉽지 않은 한계점을 가지고 있다.

현재까지 알려진 장기이식의 바이오마커
현재 두 가지의 바이오마커가 미국식품의약국(food and drug administration, FDA)의 허가를 받았다. AlloMapTM은 2001~2005년까지 심장을 이식받은 사람의 말초혈액의 RNA를 분석한 결과를 바탕으로 11개 유전자의 발현만 관찰하면 심장 생체 검사 없이도 거부반응이 일어날 환자와 아닌 환자를 감별할 수 있도록 한 kit이다. 이 11개 유전자는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR) 검사를 통해 분석할 수 있다. 2009년에 FDA로부터 의료기기로 승인을 받았지만, 아직 신장에 대해서는 이같은 전사체 바이오마커가 임상에 활용될 수 있을 정도로 개발된 것은 아니다.  다행히 신장 영역에서도 이 같은 접근 방법이 최근에 시도되고 있는 것은 다행이라 할 수 있다. 다른 하나는 ImmuKnowTM이며, 비특이적으로 환자의 T세포를 추출해 자극을 주었을 때 ATP를 얼마나 많이 분비하느냐에 따라 많이 분비하는 것은 면역이 활성화된 것, 적게 분비하는 것은 덜 활성화된 것으로 해석해 환자의 상태를 분석할 수 있다. 이를 통해 활성화된 사람은 면역억제제를 더 투여하고, 그렇지 않은 사람은 적게 투여할 수 있게 된다. 모든 면역 활성을 동시에 확인하는 것으로, 이를 토대로 면역억제제의 강도 조절이 가능하다.
이 외에 면역세포를 분석하는 면역학적 검사 기반(immunologic test based)이나 단백질체학(proteomics), 전사체학(transcriptomics) 등을 분석하는 오믹스 기반(omics based)이 있으며, 이들은 연구를 기반으로 하고 있다. 그 외 연구에서 확인된 바이오마커에 소변의 interleukin induced protein-10 (IP-10), B세포에 의한 거부반응을 보는 혈중 B-cell activating factor (BAFF), 말초 T세포에서 Foxp3 세포의 비율, 기증자의 항원을 주었을 때 IFN-γ를 만들어내는 능력을 보는 Elispot등 여러 가지가 있지만 아직 임상에서 적용될 정도는 아니다. 오믹스 기반 바이오마커에는 마이크로어레이(microarray), 단일염기 다형성(single-nucleotide polymorphism, SNPs), 차세대 염기서열분석(next generation DNA sequencer, NGS) 등이 있다.
현재까지 연자는 이식환자의 유전자 다형성이 임상에 미치는 영향에 대해 지속적인 연구를 수행해 왔으며 추후에는 기존 자료를 바탕으로 NGS를 기반으로 한 대규모 연구를 진행할 계획이다. 또한 많은 연구소에서 마이크로어레이를 통해 이식 후 거부반응이나 관용에 관한 RNA를 확인하는 방법, 소변의 RNA를 확인하는 방법, 단백질이나 펩티드를 가지고 거부반응을 확인하는 방법 등에 대하여 다양하게 연구가 진행 중이다. 특히 강동경희대병원 신장내과 연구실에서는 거부반응이 발생한 환자와 그렇지않은 환자의 샘플을 모아 multiplatform 연구를 진행하고 있다. 장기를 이식하는 것은 곧 게놈을 이식하는 것이므로 오믹스 기반 기술(omics based technology)이 향후 유용하게 활용될 것으로 전망된다. 게놈이 있는 조직을 이식함으로 인해 여러 문제가 발생하게 되는데, 신장 역시 각종 게놈에 의해 RNA, 단백질, 펩티드, 대사체가 분비되어 신장의 상태가 변하게 되는 것이다. 올해부터 중점적으로 연구하는 부분은 전사체학 기반 바이오마커(transcriptomic based biomarker) 연구이다. 모든 사람들이 염두에 두고 있는 점은 거부반응을 어떻게 예측할 것인가에 대한 부분이다. 다른 연구 주제로는 임상적 관용(operational tolerance)으로, 이는 이식 후 면역억제제를 투여하지 않아도 되는 예외적 경우를 말한다. 개인적으로 이러한 관용을 보인 환자는 외래 환자 중 이식 후 20년인 환자, 5년인 환자 총 두 명이 있었는데, 이는 매우 특별한 경우이다. 전체 신장이식환자에서 0.1% 미만에서 이런 특이한 경우가 발생한다고 알려져 있으며 우리나라에는 100명 이하로 추정되고 있다. 연구자는 면역억제제를 복용하다가 중단했는데 신장이 망가지지 않고 유지되는 환자들에서 어떤 특징이 나타내는지에 대해 관심을 가지고 연구하기 시작했다. 이 같은 연구는 미국과 유럽에서도 최근 시행된 바가 있는데 관용환자들의 말초혈액 RNA를 확인한 결과 B세포와 관련된 신호가 활성화되어 있었고, 결과적으로 관용은 B세포와 관련된 것으로 설명되고 있다.
하지만 간이식의 경우는 B세포가 아닌 자연살해세포, γδ T세포의 신호 변화가 확인된 것으로 보아 장기 특이성이 있을 것으로 생각된다. 따라서 마이크로어레이를 통해 모니터링을 할 수 있지만 장기마다 면역관용의 기전은 약간씩 다를 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
신장을 통해 직접 배출되는 소변의 RNA를 분석하는 연구도 2000년대 초반부터 Columbia의 Suthanthiran 등에 의해 많이 진행되고 있다. 처음에는 소변 RNA를 PCR 분석하여 그랜자임 B (granzyme B), 퍼포린(perforin)이 많이 검출되면 거부반응이 나타날 것으로 예측할 수 있다는 내용이 발표됐다. 2006년에는 소변에서 Foxp3 유전자를 RT-PCR 분석하여 높게 나타나는 경우 거부반응을 보였다는 내용이 발표됐다. 이는 방어기전에 의해 수치가 증가했다고 해석할 수 있다. 2013년에는 485명의 대규모 신장이식 환자의 소변을 RT-PCR 분석한 결과로부터 소변 RNA가 거부반응의 유용한 바이오마커로 활용될 수 있음이 역시 보고되었다. 이런 전사체학 기반 연구를 통해 새로운 손상에 대한 가설을 세울 수 있고, 비침습적인 새로운 바이오마커를 찾을 수 있을 것이다.

이식 거부반응 및 장기생존 바이오마커를 이용한 신장이식 면역조절 기술개발
신장이식 바이오마커 연구는 전사체, 단백-대사체, 면역세포 및 면역 활성으로 나눌 수 있다. 전사체는 gene panel, miRNA, single gene 등을 분석하는 것이며, 말초혈액은 RNA 양이 많으므로 마이크로어레이나 panel이 적합하고, 소변은 RNA 양이 적으므로 single gene 분석이 적합하다고 할 수 있다. 이 때에는 분석 후보를 정하는 것이 중요하며, 생물정보학(bioinformatics) 등을 이용하여 정할 수 있다. 향후 진행될 이식 바이오마커 연구에서 다양한 연구 플랫폼이 적극적으로 활용될 것으로 전망된다. 하지만 모든 바이오마커 연구의 한계점 역시 존재한다. 특히 단일 검체를 이용하는 경우 재현성, 조절 기전을 알기 힘든 점, 생물학적 타당성, 임상적 효용성의 문제가 발생할 수 있다. 이를 극복하기 위해 연자는 한 환자에 대해 DNA, RNA, 단백질, 면역세포 등을 동시에 확보하여 multiplatform 분석이 가능한 연구를 보건산업진흥원 과제를 지원 받아 진행하고 있다. 해당 연구는 “이식 거부반응 및 장기생존 바이오마커를 이용한 신장이식 면역조절 기술 개발”이라는 주제로 진행 중이며, 6개의 대형병원에서 1~2년 동안 약 430명 환자에 대한 샘플을 확보하고, 2년 동안 바이오마커를 개발하며 이후 4년 동안 개발된 바이오마커가 400명의 환자에 대해 잘 적용되는지 확인하고자 한다. 본 연구는 integrated genomics 연구이며, 1세부에서는 혈액 및 소변 전사체 분석, 2세부는 단백/대사체분석, 3세부에서는 면역세포 및 면역 활성을 모니터링하며, 최종적으로 임상 정보를 분석하여 맞춤 면역 치료를 개발하는 것을 목표로 하고 있다<그림2>.

   
 

 

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